Giải trình tự degradome là gì? Các bài nghiên cứu khoa học

Định nghĩa giải trình tự Degradome

Giải trình tự Degradome (degradome sequencing) là kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định các vị trí phân cắt trên phân tử RNA, đặc biệt là mRNA, bị tác động bởi các ribonuclease hoặc hệ thống cắt RNA như RISC (RNA-induced silencing complex). Đây là phương pháp then chốt để phát hiện mục tiêu trực tiếp của microRNA (miRNA) hoặc siRNA trong tế bào.

Degradome còn được gọi là PARE (Parallel Analysis of RNA Ends), đại diện cho bước tiến mới trong phân tích chức năng RNA không mã hóa. Thay vì đo mức độ biểu hiện RNA như RNA-seq, degradome giải mã các sản phẩm trung gian bị phân hủy, từ đó làm sáng tỏ cách thức RNA bị điều hòa hậu phiên mã.

Ứng dụng kỹ thuật này giúp xác nhận các tương tác miRNA–mRNA, phân tích mạng lưới điều hòa RNA và khám phá các con đường phân hủy RNA. Tính đặc hiệu, khả năng mở rộng và độ tin cậy cao của phương pháp khiến nó trở thành công cụ quan trọng trong hệ gen học chức năng.

Nguyên lý kỹ thuật của giải trình tự Degradome

Nguyên lý nền tảng của degradome sequencing dựa trên việc giải trình tự phần đầu 5’ của RNA bị cắt, đặc biệt là các đầu mang phosphate đơn (5’-monophosphate) — dấu hiệu sinh học cho thấy RNA đã từng bị enzyme cắt. Các phân tử RNA này được chọn lọc, gắn adaptor đặc hiệu, chuyển thành cDNA và giải trình tự bằng các hệ thống NGS (next-generation sequencing).

Quy trình bao gồm: (1) chiết xuất RNA tổng số, (2) làm giàu RNA bị phân mảnh có đầu 5’-monophosphate, (3) gắn adaptor ở đầu 5’, (4) tổng hợp cDNA bằng enzyme reverse transcriptase, (5) khuếch đại bằng PCR, (6) giải trình tự thế hệ mới. Sau đó, dữ liệu được căn chỉnh với hệ gen tham chiếu để xác định vị trí cắt chính xác.

Một trong những điểm quan trọng là không sử dụng enzyme loại bỏ các RNA chưa bị cắt, do đó toàn bộ dữ liệu phản ánh chính xác hiện trạng phân hủy RNA trong mẫu. Điều này đặc biệt hữu ích để xác nhận mục tiêu của các phân tử RNA điều hòa như miRNA, hoặc tìm kiếm dấu vết hoạt động của RNase trong tế bào.

So sánh với các phương pháp phân tích RNA khác

Giải trình tự degradome khác biệt với RNA-seq ở mục tiêu và bản chất tín hiệu sinh học. RNA-seq tập trung vào định lượng biểu hiện gene toàn cục, trong khi degradome cung cấp ảnh chụp chính xác các điểm phân cắt RNA, phản ánh trực tiếp các tương tác phân tử tại thời điểm lấy mẫu.

Một số khác biệt cơ bản giữa hai phương pháp được thể hiện trong bảng sau:

Tiêu chí	RNA-seq	Degradome-seq
Mục tiêu	Định lượng biểu hiện transcriptome	Xác định điểm cắt RNA do miRNA hoặc RNase
Dữ liệu đầu vào	RNA toàn phần (mũ chụp, đuôi poly-A)	RNA phân mảnh có đầu 5’ phosphate
Thông tin thu được	Biểu hiện gene	Tương tác miRNA–mRNA, điểm cắt RNA

Vì degradome cho phép ghi nhận chính xác điểm phân giải RNA, nó thường được kết hợp với RNA-seq để xây dựng bức tranh toàn diện về sự điều hòa phiên mã và hậu phiên mã trong tế bào.

Vai trò của degradome trong nghiên cứu vi sinh và thực vật

Trong sinh học thực vật, các vi sinh vật như vi khuẩn cộng sinh hoặc nấm nội sinh cũng có hệ thống điều hòa gen bằng miRNA hoặc small RNA. Degradome sequencing giúp làm rõ cơ chế tương tác này thông qua xác định trực tiếp mục tiêu phân hủy.

Nhiều nghiên cứu đã dùng degradome để phát hiện mục tiêu miRNA điều hòa các quá trình như phát triển rễ, cảm ứng miễn dịch, và phản ứng với stress như khô hạn hoặc mặn. Đặc biệt ở các loài cây trồng như Arabidopsis, lúa, ngô, miRNA đóng vai trò chính trong thích nghi môi trường.

Một số cơ sở dữ liệu tiêu biểu:

• PmiREN: tập trung vào miRNA thực vật và dữ liệu degradome xác nhận.
• psRNATarget: dự đoán và phân tích mục tiêu miRNA với hỗ trợ từ dữ liệu degradome.

Nhờ đó, degradome sequencing đã trở thành công cụ tiêu chuẩn trong nghiên cứu biểu hiện gene ở thực vật và vi sinh vật tương tác.

Ứng dụng trong phân tích mục tiêu microRNA

Giải trình tự degradome đóng vai trò then chốt trong việc xác minh mục tiêu của các microRNA (miRNA) – một lớp RNA không mã hóa có vai trò điều hòa biểu hiện gene thông qua tương tác với mRNA. Khi miRNA bắt cặp hoàn hảo hoặc gần hoàn hảo với mRNA đích, nó sẽ kích hoạt quá trình phân hủy mRNA thông qua cắt endonuclease, thường là bởi phức hợp RISC. Degradome cho phép ghi nhận trực tiếp vị trí phân cắt này, tạo bằng chứng thực nghiệm cho tương tác miRNA–mRNA.

Một công cụ phổ biến để biểu diễn dữ liệu degradome là biểu đồ T-plot (Target plot), trong đó các đỉnh thể hiện mức độ tích tụ đầu đọc tại các vị trí cụ thể trên gene. Điểm cắt được gây ra bởi miRNA thường sẽ xuất hiện dưới dạng đỉnh cao rõ rệt và nằm tại vị trí thứ 10–11 tính từ đầu 5' của miRNA. Phân tích T-plot giúp phân biệt các điểm cắt đặc hiệu và nền nhiễu.

Khi kết hợp degradome với dữ liệu small RNA sequencing, các nhà nghiên cứu có thể xây dựng bản đồ chi tiết về mạng lưới điều hòa miRNA trong hệ sinh học. Các thuật toán như CleaveLand4, PAREsnip2 hoặc psRobot hỗ trợ so sánh trình tự, căn chỉnh vị trí cắt và phân loại mức độ tin cậy của tương tác.

Phân loại các dạng phân hủy mRNA từ degradome

Để đánh giá mức độ tin cậy của các điểm phân cắt RNA, hệ thống phân loại từ category 0 đến 4 được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu degradome. Cách phân loại này dựa vào mức độ tích tụ của đầu đọc tại vị trí cắt so với các vị trí khác trên cùng gene:

• Category 0: điểm cắt có số lượng đầu đọc cao nhất duy nhất trên transcript, thể hiện sự tin cậy tuyệt đối.
• Category 1: điểm cắt có số đọc bằng đỉnh cao nhất, nhưng có nhiều điểm cao khác cùng mức.
• Category 2: điểm cắt có số đọc thấp hơn đỉnh cao nhất nhưng vẫn đáng kể.
• Category 3: điểm cắt yếu, gần mức nền, khó phân biệt với nhiễu.
• Category 4: tín hiệu rất yếu, độ tin cậy thấp.

Phân loại này hỗ trợ lọc ra các tương tác tiềm năng có ý nghĩa sinh học và giúp tránh hiện tượng dương tính giả trong phân tích. Nhiều bài báo khoa học chỉ công nhận các mục tiêu miRNA thuộc category 0 hoặc 1 là có ý nghĩa sinh học rõ rệt.

Các công cụ và pipeline phân tích dữ liệu degradome

Phân tích dữ liệu degradome đòi hỏi pipeline bioinformatics chuyên biệt để xử lý, căn chỉnh, phát hiện điểm cắt và gán tương tác RNA–RNA. Dưới đây là một số công cụ phổ biến được sử dụng rộng rãi:

• CleaveLand4: hỗ trợ định vị và phân loại điểm phân cắt từ dữ liệu degradome, kết hợp với dữ liệu miRNA từ miRBase.
• PAREsnip2: cho phép phân tích các tương tác RNA–RNA tốc độ cao và chính xác, phù hợp với dữ liệu lớn.
• psRobot: tích hợp dự đoán mục tiêu miRNA và xác nhận với dữ liệu degradome, đặc biệt hiệu quả trong thực vật.

Ngoài ra, các bước tiền xử lý dữ liệu thường bao gồm: (1) cắt bỏ adaptor, (2) lọc chất lượng, (3) loại bỏ trình tự rRNA, (4) căn chỉnh với hệ gen tham chiếu bằng Bowtie hoặc STAR, (5) phân tích thống kê và trực quan hóa kết quả.

Hạn chế và thách thức kỹ thuật

Dù có độ đặc hiệu cao, degradome sequencing vẫn gặp một số khó khăn kỹ thuật cần lưu ý. Một trong những thách thức lớn là tín hiệu phân giải thấp đối với các transcript biểu hiện yếu, dẫn đến khó phát hiện điểm cắt chính xác. Ngoài ra, một số RNase khác cũng có thể tạo ra các đầu 5’-monophosphate tương tự, gây nhiễu trong việc gán tương tác.

Việc yêu cầu RNA chất lượng cao, không bị phân hủy và có đủ số lượng cũng là yếu tố hạn chế trong thực địa, đặc biệt với mẫu hiếm hoặc mẫu cổ. Để tăng độ tin cậy, nhiều nghiên cứu kết hợp sử dụng replicates sinh học và kỹ thuật, đồng thời chuẩn hóa quy trình xử lý mẫu từ bước tách RNA đến thư viện NGS.

Bên cạnh đó, các thuật toán hiện tại vẫn có giới hạn trong việc phát hiện tương tác không hoàn toàn bổ sung (mismatch hoặc wobble pairing), vốn phổ biến ở động vật. Việc cải tiến mô hình dự đoán và tích hợp học máy đang được nghiên cứu để khắc phục vấn đề này.

Triển vọng nghiên cứu và ứng dụng

Degradome sequencing đang ngày càng được tích hợp trong các nghiên cứu hệ gen chức năng, đặc biệt trong bối cảnh sinh học đa omics. Khi kết hợp cùng transcriptome, epigenome và proteome, degradome góp phần xây dựng bản đồ toàn diện về cơ chế điều hòa gen. Ứng dụng trong chọn giống cây trồng, phát hiện gene kháng bệnh hoặc chống stress là những hướng đi thực tiễn.

Trong y học, degradome mở ra khả năng phát hiện các dấu ấn RNA bị phân hủy bất thường trong ung thư, thoái hóa thần kinh hoặc các rối loạn miễn dịch. Ngoài tương tác miRNA–mRNA, degradome còn giúp khám phá vai trò của tRNA fragments, snoRNA-derived RNAs hoặc long non-coding RNAs trong mạng lưới phân tử.

Sự phát triển của thiết bị giải trình tự thế hệ mới, mô hình AI và các nền tảng dữ liệu mở như PmiREN đang góp phần đẩy mạnh việc khai thác degradome như một công cụ sinh học phân tử chiến lược trong nghiên cứu và ứng dụng.

Tài liệu tham khảo

1. German, M. A., et al. (2009). Global identification of microRNA–target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends. Nature Biotechnology, 27(5), 472–478. PMC3278750
2. Addo-Quaye, C., et al. (2009). CleaveLand: a pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets. Bioinformatics, 25(1), 130–131. DOI
3. Thody, J., et al. (2018). PAREsnip2: a tool for high-throughput prediction of small RNA targets. Bioinformatics, 34(20), 3566–3568. DOI
4. Lei, J., et al. (2021). PmiREN: a comprehensive encyclopedia of plant miRNAs. Nucleic Acids Research, 49(D1), D1114–D1121. pmiren.com
5. psRNATarget: A Plant Small RNA Target Analysis Server. psRNATarget